固相萃取與固相微萃取應(yīng)用之原理

一 固相萃取

固相萃取（Solid Phase Extraction，SPE）是一種基于液-固分離萃取的試樣預(yù)處理技術(shù)，由柱液相色譜技術(shù)發(fā)展而來(lái)。SPE技術(shù)自70年代后期問(wèn)世以來(lái)，由于其、可靠及耗用溶劑量少等優(yōu)點(diǎn)，在環(huán)境等許多領(lǐng)域得到了快速發(fā)展。在國(guó)外已逐漸取代傳統(tǒng)的液-液萃取而成為樣品預(yù)處理的可靠而有效的方法。

SPE技術(shù)基于液相色譜的原理，可近似看作一個(gè)簡(jiǎn)單的色譜過(guò)程。吸附劑作為固定相，而流動(dòng)相是萃取過(guò)程中的水樣。當(dāng)流動(dòng)相與固定相接觸時(shí)，其中的某些痕量物質(zhì)（目標(biāo)物）就保留在固定相中。這時(shí)用少量的選擇性溶劑洗脫，即可得到富集和純化的目標(biāo)物。固相萃取可分為在線萃取線萃取前者萃取與色譜分析同步完成；而后者萃取與色譜分析分步完成，兩者在原理上是一致的。

一般固相萃取的操作步驟包括固相萃取柱（即吸附劑）的選擇、柱子預(yù)處理、上樣、淋洗、洗脫。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需要具體考慮的因素如下：

1）吸附劑的選擇

a.傳統(tǒng)吸附劑

在環(huán)境分析中為常用的反相吸附劑較適用于水樣中的非極性到中等極性的有機(jī)物的富集和純化。其中有代表性的鍵合硅膠C18和鍵合硅膠C8等。該類吸附劑主要通過(guò)目標(biāo)物的碳?xì)滏I同硅膠表面的官能團(tuán)產(chǎn)生非極性的范德華力或色散力來(lái)保留目標(biāo)物。
正相吸附劑包括硅酸鎂、氨基、氰基、雙醇基鍵合硅膠及氧化鋁等，主要通過(guò)目標(biāo)物的極性官能團(tuán)與吸附劑表面的極性官能團(tuán)的極性相互作用（氫鍵作用等）來(lái)保留溶于非極性介質(zhì)的極性化合物。由于其特殊的作用原理，在環(huán)境分析中常用于與其它類型的吸附柱聯(lián)用，吸附去除干擾物，實(shí)現(xiàn)樣品純化。

離子交換吸附劑則主要包括強(qiáng)陽(yáng)離子和強(qiáng)陰離子交換樹脂，這些樹脂的骨架通常為苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，主要是通過(guò)目標(biāo)物的帶電荷基團(tuán)與鍵合硅膠上的帶電荷基團(tuán)相互靜電吸引實(shí)現(xiàn)吸附的。

b.抗體鍵合吸附劑（Immunosorbents-IS）

這類新型吸附劑充分利用了生物免疫抗原-抗體之間的高靈敏性和高選擇性，尤其適應(yīng)于水中痕量有機(jī)物的富集與分離。其特點(diǎn)為，由于絕大多數(shù)有機(jī)污染物為低分子量物質(zhì)，不能在動(dòng)物體內(nèi)引發(fā)免疫反應(yīng)，所以需把待定污染物鍵合到牛血清白蛋白的生物大分子載體上，使其具有免疫抗原活性，再注入純種動(dòng)物體內(nèi)（如兔或羊），產(chǎn)生抗體，經(jīng)雜交瘤技術(shù)制得相應(yīng)于該有機(jī)污染物的單克隆抗體。將抗體鍵合到反相吸附劑的硅膠表面或聚合物表面（如C18固定相），就制得了抗體鍵合吸附劑，可用于分離、富集特定污染物。研制開發(fā)能專門檢測(cè)各種優(yōu)先污染物的單克隆抗體或多克隆抗體已成為SPE技術(shù)的前沿研究領(lǐng)域。

抗體鍵合吸附劑洗脫時(shí)一般可采用20%～80%的甲醇-水溶液，該類吸附劑經(jīng)冷藏保存可多次使用。進(jìn)行SPE操作時(shí)應(yīng)根據(jù)目標(biāo)物的性質(zhì)選擇適合的吸附劑。表1- 1給除了常用的吸附劑類型及其相關(guān)的分離機(jī)理、洗脫劑性質(zhì)和待測(cè)組分的性質(zhì)。

吸附劑的用量與目標(biāo)物性質(zhì)（極性、揮發(fā)性）及其在水樣中的濃度直接相關(guān)。通常，增加吸附劑用量可以增加對(duì)目標(biāo)物的保留，可通過(guò)繪制吸附曲線確定吸附劑用量。

2）柱子預(yù)處理

活化的目的是創(chuàng)造一個(gè)與樣品溶劑相容的環(huán)境并去除柱內(nèi)所以雜質(zhì)。通常需要兩種溶劑來(lái)完成任務(wù)，*個(gè)溶劑（初溶劑）用于凈化固定相，另一個(gè)溶劑（終溶劑）用于建立一個(gè)適合的固定相環(huán)境使樣品分析物得到適當(dāng)?shù)谋Ａ簟Ｃ恳换罨軇┯昧考s為1～2 mL/100 mg固定相。

終溶劑不應(yīng)強(qiáng)于樣品溶劑，若使用太強(qiáng)的溶劑，將降低回收率。通常采用一個(gè)弱于樣品溶液的溶劑不會(huì)有什么問(wèn)題。制得注意的是，在活化的過(guò)程中和結(jié)束時(shí)，固定相都不能抽干，因?yàn)檫@將導(dǎo)致填料床出現(xiàn)裂縫，從而得到低的回收率和重新性，樣品也沒(méi)得到應(yīng)有的凈化。如果在活化過(guò)程中柱床出現(xiàn)裂縫，上述活化步驟都得重復(fù)。

3) 上樣

將樣品加入到固相萃取柱并迫使樣品溶液通過(guò)固定相，使分析物和一些樣本干擾物保留在固定相上。為了保留分析物，溶解樣品的溶劑必須較弱。如果太強(qiáng)，分析物將不被保留，結(jié)果回收率將會(huì)很低，這一現(xiàn)象叫穿漏（breakthrough）。盡可能使用弱的樣品溶劑，可以使溶質(zhì)得到強(qiáng)的保留或者說(shuō)窄的譜帶。只要不出現(xiàn)穿漏，允許采用大體積的上樣量（0.5～1L）。

有時(shí)候固定樣品必須用一個(gè)很強(qiáng)的溶劑進(jìn)行萃取，這樣的萃取液是不能直接上樣的。所以萃取液要用一個(gè)弱溶劑稀釋，以得到一個(gè)合適的溶劑總強(qiáng)度進(jìn)行上樣。例如一個(gè)土壤樣品采用50%甲醇萃取，得到2 mL萃取液，用8 mL水稀釋，得到10%的甲醇溶液，這樣就可以直接上反相固相萃取柱而不存在穿漏問(wèn)題。

4) 淋洗

分析物得到保留后，通常需要淋洗固定相以洗掉不需要的樣品組分，淋洗溶劑的洗脫強(qiáng)度略強(qiáng)于或等于上樣溶劑。淋洗溶劑必須盡量強(qiáng)，以洗掉盡量多的干擾組分，但不能強(qiáng)到可以洗脫任何一個(gè)分析物的程度。溶劑體積可為0.5～0.8 mL/100 g固定相。

淋洗時(shí)不宜使用太強(qiáng)溶劑，太強(qiáng)溶劑會(huì)將強(qiáng)保留雜質(zhì)洗下來(lái)。使用太弱溶劑，會(huì)使淋洗體積加大。可改為強(qiáng)、弱溶劑混合；但混用或前后使用的溶劑必須互溶。

5）洗脫

淋洗過(guò)后，將分析物從固定相上洗脫，洗脫溶劑用量一般為0.5～0.8 mL/100 g固定相。而溶劑必須進(jìn)行認(rèn)真選擇，溶劑太強(qiáng)，一些更強(qiáng)保留的不必要的組分將被洗出來(lái)；溶劑太弱，就需要更多的洗脫液來(lái)洗出分析物，這樣固相萃取柱的濃縮功效就會(huì)削弱。

在選擇洗脫溶劑時(shí)還應(yīng)注意溶劑的互溶性。后流過(guò)柱床的溶劑必須與前一溶劑互溶，一個(gè)不與柱內(nèi)殘留溶劑互溶的溶劑是不能與固定相充分作用的，當(dāng)然也不會(huì)出現(xiàn)適當(dāng)?shù)囊汗谭峙洌瑢?dǎo)致差的回收率和不理想的凈化效果。如果使用互溶的溶劑有困難，就必須干燥柱床；干燥的方法是讓氮?dú)饣蚩諝馔ㄟ^(guò)柱床10～15 min；或離心，干燥效果更好。

綜上所述，固相萃取技術(shù)簡(jiǎn)便易行，能夠明顯改善色譜分離，延長(zhǎng)色譜柱壽命，降低方法檢出限。與傳統(tǒng)的液-液萃取方法相比，SPE固相萃取顯著的優(yōu)勢(shì)體現(xiàn)在：提高樣品處理通量；大大減少溶劑的消耗和廢物的產(chǎn)生；回收率高，重現(xiàn)性好；極低的雜質(zhì)干擾；無(wú)乳化現(xiàn)象；多種分離模式選擇；易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。但是實(shí)驗(yàn)中所用的消耗品固相萃取柱價(jià)格高，實(shí)驗(yàn)所需費(fèi)用不可忽視。

二 固相微萃取

固相微萃取（Solid-Phase Microextraction,簡(jiǎn)寫為SPME）是近年來(lái)上興起的一項(xiàng)試樣分析前處理新技術(shù)。是在固相萃取基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的，它保留了其所有的優(yōu)點(diǎn),摒棄了其需要柱填充物和使用溶劑進(jìn)行解吸的弊病，只要一支類似進(jìn)樣器的固相微萃取裝置即可完成全部前處理和進(jìn)樣工作。

固相微萃取主要針對(duì)有機(jī)物進(jìn)行分析，根據(jù)有機(jī)物與溶劑之間“相似者相溶”的原則，利用石英纖維表面的色譜固定相對(duì)分析組分的吸附作用，將組分從試樣基質(zhì)中萃取出來(lái)，并逐漸富集，完成試樣前處理過(guò)程。在進(jìn)樣過(guò)程中，利用氣相色譜進(jìn)樣器的高溫，液相色譜、毛細(xì)管電泳的流動(dòng)相將吸附的組分從固定相中解吸下來(lái)，由色譜儀進(jìn)行分析。

SPME萃取方式的選擇主要與待測(cè)物的揮發(fā)性、基質(zhì)和探針固定相涂層的性質(zhì)有關(guān)。 SPME有三種不同的萃取方式：頂空萃取、空氣萃取和直接萃取。對(duì)揮發(fā)性特別強(qiáng)的樣品,可采用頂空或空氣萃取，對(duì)于半揮發(fā)性和不揮發(fā)性樣品來(lái)說(shuō)，應(yīng)采用直接萃取。

影響SPME萃取效率的因素很多，主要是對(duì)干擾分析物吸附和解析的因素進(jìn)行優(yōu)化。影響分析物吸附的主要參數(shù)有纖維表面固定相類型、萃取時(shí)間、離子強(qiáng)度、pH值、溫度、樣本體積和攪拌。對(duì)于SPME-GC，分析物解析與時(shí)間和溫度有關(guān)，而對(duì)于SPME-HPLC，分析物解析則主要與溶劑類型、體積和時(shí)間有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中萃取效果的影響因素主要有以下幾方面：

1）纖維表面固定相類型

選用固定相時(shí)一般應(yīng)從兩方面考慮：(i)分析物和固定相的極性相匹配，即應(yīng)當(dāng)綜合考慮分析組分在各相中的分配系數(shù)、極性與沸點(diǎn)，根據(jù)“相似者相溶”的原則，選取適合分析組分的固定相；(ii) 靈敏度隨固定相厚度的增加而增加。

2）萃取時(shí)間

萃取時(shí)間是從石英纖維與試樣接觸到吸附平衡所需要的時(shí)間。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性良好，應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中保持萃取時(shí)間一定。影響萃取時(shí)間的因素很多，如分配系數(shù)、試樣的擴(kuò)散速度、試樣量、容器體積、試樣本身基質(zhì)、溫度等。在萃取初始階段，分析組分很容易富集到石英纖維固定相中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，富集的速度越來(lái)越慢，接近平衡狀態(tài)時(shí)即使時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)富集也沒(méi)有意義了，因此在摸索實(shí)驗(yàn)方法時(shí)必須做富集－時(shí)間曲線，從曲線上找出佳萃取時(shí)間點(diǎn)，即曲線接近平緩的短時(shí)間。一般萃取時(shí)間在15～180 min。

3）離子強(qiáng)度

向液體試樣中加入少量氯化鈉、硫酸鈉等無(wú)機(jī)鹽可增強(qiáng)離子強(qiáng)度,降低極性有機(jī)物在水中的溶解度即起到鹽析作用，使石英纖維固定相能吸附更多的分析組分。一般情況下可有效提高萃取效率，但并不一定適用于任何組分,如Boyd-Boland等在對(duì)22種含氮?dú)⑾x劑檢驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)使用多數(shù)組分在加入氯化鈉后會(huì)明顯提高萃取效果，但對(duì)惡草靈、乙氧氟甲草醚等農(nóng)藥無(wú)效；Fisher等在分析酒中污染物時(shí),加入無(wú)機(jī)鹽的比不加的分析結(jié)果高25%。加入無(wú)機(jī)鹽的量需要根據(jù)具體試樣和分析組分來(lái)定。

4）pH

改變pH值同使用無(wú)機(jī)鹽一樣能改變分析組分與試樣介質(zhì)、固定相之間的分配系數(shù),對(duì)于改善試樣中分析成分的吸附是有益的。由于固定相屬于非離子型聚合物，故對(duì)于吸附中性形式的分析物更有效。調(diào)節(jié)液體試樣的pH值可防止分析組分離子化，提高被固定相吸附的能力。對(duì)于酸性化合物，萃取效率隨pH值降低而提高，在低pH值，酸性化合物的酸-堿平衡移向中性化和物，更有利于分析物被固定相吸附。相反，對(duì)于堿性化合物則是隨pH值降低，化合物離子化，萃取效率隨之減小。在實(shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，pH值在4～11間改變，對(duì)三嗪、硝基苯胺、取代尿嘧啶、硫代氨基甲酸酯、氯代乙酰胺、聯(lián)苯醚、氨基化合物和含氧二唑類除草劑萃取效率無(wú)影響。然而在pH 2時(shí)，聯(lián)苯醚和二硝基苯胺的萃取效率提高。

5）溫度

分析物進(jìn)入固定相的平衡時(shí)間與萃取溫度有關(guān)，因而需要選擇適當(dāng)?shù)妮腿囟却偈乖诤侠淼臅r(shí)間范圍內(nèi)獲得滿意的靈敏度。對(duì)于浸入式SPME，適當(dāng)升高溫度可使分子運(yùn)動(dòng)加快，分子擴(kuò)散速度更快，從而萃取相/水相之間的平衡時(shí)間可以縮短。其對(duì)三嗪和硫代氨基甲酸酯的優(yōu)化萃取溫度在55～60℃。對(duì)于頂空式SPME，適當(dāng)升高溫度可以提高液上氣體濃度，從而提高分析靈敏度。其對(duì)人體血液和尿液中三嗪類除草劑的佳萃取溫度介于90～100℃之間。

6）攪拌

萃取效率與分析物在樣本基質(zhì)和固定相間的平衡有關(guān)，而分析物平衡時(shí)間與分析物在水相間質(zhì)量傳遞速率有關(guān)。攪拌和超聲波均能使分析物從基質(zhì)中快速轉(zhuǎn)移至固定相，從而降低萃取時(shí)間。雖然攪拌速度越快，平衡時(shí)間越短，但是過(guò)度攪拌也會(huì)干擾平衡時(shí)間和精密度。

7）樣本體積

由于固相微萃取是一個(gè)固定的萃取過(guò)程，為保證萃取的效果需要對(duì)試樣量、試樣容器的體積進(jìn)行選擇。Denis等在利用頂空法檢測(cè)14種半揮發(fā)性有機(jī)氯農(nóng)藥的研究中指出，試樣量與試樣容器的體積對(duì)于保證結(jié)果有很大關(guān)系，試樣量與試樣容器體積之間存在有匹配關(guān)系，試樣量增大的情況下，重現(xiàn)性明顯變好,檢出量提高。
    8）解析

對(duì)于SPME-GC來(lái)說(shuō)，GC的汽化室可用于分析物從纖維上的解吸。當(dāng)溫度上升時(shí)，分析物對(duì)纖維的親和力下降從而釋放出來(lái)。汽化室較小的體積能夠保證解吸下來(lái)的分析物由載氣迅速轉(zhuǎn)入色譜柱。對(duì)于大多數(shù)化合物而言，解吸通常在兩分鐘內(nèi)完成。GC的熱解吸受若干參數(shù)的影響，如汽化室的溫度和載氣的流速等，它們決定了SPME的解吸時(shí)間。一般，汽化室溫度的設(shè)定在可保持纖維涂層穩(wěn)定的大溫度。高解析溫度有助于減少滯留影響。一般SPME-GC的熱解析佳溫度和時(shí)間分別為200～300℃、2～15 min。

SPME-HPLC的聯(lián)用與GC聯(lián)用的不同之處在于解吸過(guò)程和探針的形狀，即HPLC是通過(guò)使用微量溶劑洗滌萃取纖維來(lái)解析萃取物并直接進(jìn)入后續(xù)的HPLC分析，而非GC快速熱解吸。在SPME和HPLC聯(lián)用中必須解決接口技術(shù)，以實(shí)現(xiàn)分析物的解吸。

1997年Eisert和Pawliszyn提出了一種自動(dòng)進(jìn)樣的SPME-HPLC聯(lián)用裝置—In Tube SPME-HPLC。在HPLC的自動(dòng)進(jìn)樣閥和取樣器之間的是一根涂有SPME固定相涂層的GC石英毛細(xì)管。當(dāng)處于進(jìn)樣位置時(shí)，針頭吸入的樣品溶液中的分析物分配到石英管壁的固定相上，切換到裝樣位置時(shí)，吸入溶劑，將被吸附的組分轉(zhuǎn)移到樣品管中。再切換到進(jìn)樣位置，樣品管內(nèi)的溶液隨流動(dòng)相進(jìn)入分析柱，進(jìn)行色譜分析。此裝置的特點(diǎn)是自動(dòng)進(jìn)樣，避免了峰展寬。Daimon等還提出一種改進(jìn)的SPME- HPLC接口。在分析時(shí)，用電加熱石英纖維的導(dǎo)管，增加解吸率。

SPME與傳統(tǒng)的LLE、SPE相比，快速、簡(jiǎn)單、不需要使用溶劑，可以與GC、HPLC聯(lián)用，有好的線性和靈敏度。但是SPME需要專門的萃取器，價(jià)格比較昂貴，纖維的使用壽命有限，需要不停更換。